第六节　肾脏生理学功能的研究方法

一、单个肾小球入球动脉灌注技术

肾脏是一个高血流量的器官，肾血流量通常占心输出量的25%。肾脏的自主调节机制对于维持肾血流量和肾小球滤过率非常重要，而维持肾血流量和肾小球滤过率相对稳定的重要机制之一是肾小球入球动脉的肌源性反应。当血压升高时，肾小球入球动脉管壁的平滑肌受到牵张刺激而收缩，血流阻力增大，使肾小球毛细血管的血流量相对稳定，肾小球灌注压不致升高，因而有效滤过压和肾小球滤过率无明显变化；当血压降低时，入球动脉血管舒张，血流阻力减小，使肾小球毛细血管的血流量相对稳定，肾小球灌注压不致下降，因而有效滤过压和肾小球滤过率也无明显变化。肾脏自主调控机制使得肾脏在灌注压发生变化时，也能维持稳定的肾血流量和肾小球滤过率。

肾脏的叶间动脉以及最重要的入球动脉是主要的肾小球前阻力血管，这些血管的张力介导着大多数肾脏灌注压力变化所诱导的肾血流量和肾小球滤过率的自动调节。而出球动脉通常不参与到肾血流量的自动调节，但是它们在低盐饮食和RAS被激活时可能有助于肾小球滤过率的自动调节。

单个肾小球入球动脉灌注技术是在模拟体内肾小球入球动脉的生理环境，根据研究目的，可加入相应的药物对动脉进行刺激，通过检测动脉张力及直径的变化，来评估血管的生理作用或在病理状态下的变化情况。具体步骤如下：麻醉动物后迅速取出新鲜的肾脏，在显微镜下用微型镊子及手术刀分离解剖出入球动脉及其所连接的单个肾小球，而后在特制的模拟人生理环境的灌注平台上，在共聚焦显微镜下经微灌注系统灌注肾小球入球动脉。微灌注系统主要由两端可进行位置调整的玻璃管组成，包括内径约10μm固定管，内径约5μm的灌注管以及交换管，分别用于固定肾小球、吸引肾小球入球小动脉头端，提供流体和压力及交换液体（图2-4）。进行灌注时，首先在倒置显微镜下用左侧固定管负压吸引肾小球，再将肾小球入球小动脉开口吸入右侧固定管中，最后将套管中的灌注管的尖端开口手动插入到肾小球入球小动脉的管腔中进行灌注。从解剖、分离到灌注成功需在60分钟内完成。灌注台中的生理溶液以及玻璃管的灌注压均精确地模拟人正常生理状态下的体内环境。

大量的研究表明高血压与肾小动脉的动脉硬化以及肾小管间质炎症、纤维化和肾小球硬化有关。高血压所引起的肾小动脉的血管重塑可能会损害肾血流量和肾脏灌注压，并且增加血管外周阻力，进而导致高血压的进展。研究也发现在其他疾病的状态下，如糖尿病和肾损害性疾病，肾脏的入球动脉的肌张力会发生改变进而导致肾脏的自主调节功能紊乱，这同时也会进一步恶化疾病的进展。因此充分地了解肾脏入球动脉肌张力的功能，可以让我们更好地去研究相关疾病发生发展的机制。

二、肾脏微穿刺技术

评估单个肾单位肾功能的技术对于充分了解哺乳动物的肾脏功能是必不可少的。肾脏微穿刺技术能够对肾小球滤过和血流动力学以及肾小管上皮转运活动进行复杂的研究，它是综合评估肾功能的重要工具。肾脏微穿刺技术让我们更好地对肾脏生理学和单个肾单位的功能进行充分的理解，而且这是其他方法替代不了的。

肾脏微穿刺技术为在体实验，用微穿刺管穿刺进入肾小管近曲小管部位，而后灌注液流，然后测量特定位点的压力改变，来推测管球反馈的变化。具体步骤：小鼠麻醉后置于36.5℃的恒温箱中，暴露小鼠左侧肾脏，选择其中一个近曲小管，然后用一个装有人造肾小管液的微量吸液管进行近曲小管穿刺（图2-5），用一个油脂吸管插入同一个位点注射油脂阻断液流，再用一个装满人造肾小管液和染色剂的灌注滴管插入距离油脂阻断点的最近一个近曲小管下游的最末端，把灌注滴管与微灌注泵连接起来，最后把装有氯化钾液体的压力管连接到微压力系统上，用它插入油脂阻断点的上游用来测量近端的液流阻断压力（Psf）。当灌注率从0到40nl/min改变时，Psf会产生微小的改变，这个数据即认为是管球反馈（TGF）的指示值。

肾脏微穿刺技术的应用，使我们能更充分地了解肾单位中的液体和电解质生理状态。随着转基因小鼠和大鼠模型的陆续建立，人们对肾脏微穿刺技术产生了更大兴趣，试图研究基因和遗传的改变对于肾脏上皮和血流动力学功能的影响作用。由于该技术操作复杂，因此纵观近50年来，该技术并没有得到普及应用，但基于它在肾脏功能的研究中的不可替代性，应该对该技术给予重视。

三、核磁共振成像评估肾脏功能

肾脏的病变会造成不同程度的肾功能损害。因此，通过监测肾功能的变化评价肾脏疾病程度，进而用于指导临床治疗及判断预后具有重要意义。肾脏具有血流灌注量大、血氧代谢活跃、含水量丰富等特点，为核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的应用提供了理论基础。目前，采用肾脏功能MRI在评价肾脏血流灌注、血氧代谢水平和水分子扩散特性等方面取得了进展。

采用动脉自旋标记MRI技术，以动脉血中的水质子作为内源性示踪物，可无创地定量分析肾实质血流灌注情况，目前在多种肾脏疾病中已得到应用。动脉自旋标记MRI技术不仅有助于区分不同病理类型的肾脏占位性病变，还可以提供关于肿瘤活性的临床信息和评估治疗效果。该技术作为无创、定量评估肾脏灌注水平的方法，在肾脏功能的研究与临床应用中具有广阔的前景。在肾脏血氧代谢特性的评估方面，血氧水平依赖成像技术应用氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的磁性不同，能够对组织器官的氧合状态进行定量评价，其定量评价指标能直接反映组织内脱氧血红蛋白的浓度，在肾脏功能的评价中具有一定的临床应用价值。核磁共振弹性成像是一种利用机械剪切波评估组织硬度的无创性技术，其评价指标是弹性（或硬度），可以反映组织的纤维化程度。目前，它在肾动脉狭窄的猪模型中已初步证实在肾脏的应用是可行的，并显示皮质的弹性受血流灌注压的影响较大，而在髓质弹性的监测中有较大的应用潜能。该技术在将来可能会对其他肾病的诊断提供新思路和新方法。

肾功能MRI研究走过了漫长的道路，虽然取得了一定进展，使这些无创性方法为肾功能的评估提供了有价值的信息，但肾功能MRI也面临新的挑战，目前尚缺乏标准采集和处理数据的方案，限制了这些肾功能MRI技术的全面推广与应用。为解决这些问题，需要更多复杂、精细的模型和大量实验来全面深入地理解与验证这些技术，以及了解它们与病理和生理状态的关系，以便更好地为临床服务。

四、小分子量蛋白质评估肾小球滤过率

虽然菊粉仍然是测量肾小球滤过率（GFR）的黄金标准，然而，由于它操作的局限性，在临床上不能广泛应用。长期以来很多学者一直提出可以用小分子量蛋白质作为GFR的标志物，因为它们常常几乎可以通过肾小球滤过膜自由过滤。在正常功能的肾脏中，这些小分子量蛋白质几乎完全被近曲肾小管细胞重新吸收和降解。目前的研究进展中，比较受关注的有血清胱抑素C和β2-微球蛋白。β2-微球蛋白是一种小分子蛋白质，主要由血小板和淋巴细胞合成，通过出胞方式运输至胞外，进入循环。β2-微球蛋白可由肾小球滤过膜进入到肾小管，在肾小管中进行分解代谢。肾功能受损伤后，β2-微球蛋白的分解代谢受到抑制，因此循环中含量显著提高，因此测定血β2-微球蛋白水平能反映早期肾功能的变化，但是其浓度易受炎症、造血细胞变化、恶性肿瘤、狼疮、免疫抑制剂等多种因素的影响。

血清胱抑素C具有极低的分子量，本身携带正电荷，能够自由穿梭于肾小球滤过膜，并且由肾小管完全重吸收。肾小管本身不分泌血清胱抑素C，重吸收的血清胱抑素C全部来自肾小球滤过，因此，血清胱抑素C作为一种内源性标记物，能够理想地反应肾小球滤过率水平。有研究用人胱抑素C在大鼠身上的实验表明，胱抑素C可以自由通过肾小球滤过，至少有99%的胱抑素C在肾小管细胞中降解吸收。当对大鼠的主动脉进行结扎进而降低GFR时，胱抑素C的肾血浆清除率与51Cr-EDTA（一种衡量GFR的标记物）强烈相关。胱抑素C在荟萃分析中已经证实了它作为GFR标志物及其用它来评估GFR的优势。研究还发现，与血清肌酐相比，血清胱抑素C与用金标准测量的GFR更相关，且血清胱抑素C受年龄、性别、肌肉量和饮食的影响相比肌酐更小。通过对人群的研究，有人定义胱抑素C的参考值：4～19岁人群为（0.75±0.09）mg/L，20～59 岁的男性为（0.74±0.10）mg/L 和女性为（0.65±0.09）mg/L，>60岁人群为（0.83±0.10）mg/L。此外，有研究发现，联合血清胱抑素 C和β2-微球蛋白二者进行检测，可以提高诊断敏感性。